Posouzení životaschopnosti mikrobiálních buněk fluorescenční mikroskopií

08. 02. 2012

Související obrázky

Obr. 1

Obr. 3Obr. 2Obr. 4

Ve výzkumné biologické praxi, především v mikrobiologii, jsme často vystavení úkolu stanovit životaschopnost buněk, počet buněk, zhodnocení jejich fysiologického stavu, sledování účinnosti dezinfekčního nebo konzervačního účinku apod. K těmto účelům se využívají klasické kultivační metody, které jsou častěji nahrazovány novějšími technikami. Jednou z nich je i fluorescenční mikroskopie, která je nezávislá, vyniká rychlostí, specifitou a vysokou citlivostí.

Pojem životaschopnost (viabilita) je definován jako schopnost buněk se množit a vykazovat metabolickou aktivitu v daných podmínkách, což jedním slovem můžeme vyjádřit jako životaschopnost. Tato vlastnost se dobře určuje pomocí optických metod. K lepšímu hodnocení fyziologického stavu zkoumaných buněk, kvality biomasy, biologického znehodnocení produktu se využívají i barviva. Podle povahy barviva lze životaschopnost buněk posuzovat buď ve světelném, nebo fluorescenčním mikroskopu. Při použití světelné mikroskopie se nejvíce používá jako barvivo methylénová modř (obr. 1).

Fluorescenční mikroskopie využívá značení buněk citlivými a často velmi selektivními barvivy. Mezi nejčastěji používaná barviva patří zejména DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) (obr. 2), akridinová oranž (obr. 3), propidium jodid (PI), hexidium jodid, SYTO®9. Všechny vykazují fluorescenci, a to na různých vlnových délkách. V dnešní době se stále více začínají používat tzv. kity (jedná se o směsi barviv). Kity mohou být použity pro odlišné bakteriální druhy a dokáží během několika minut kvantitativně rozlišit živé a mrtvé bakteriální buňky. Například kit LIVE/DEAD® BacLight Bacterial Viability Kits (obr. 4) se využívá k posuzování životaschopnosti bakteriálních buněk. Obsahuje dvě fluorescenční barviva - SYTO® 9 a PI. SYTO® 9 vstupuje neporušenými membránami, kdežto PI prostupuje pouze poškozenými membránami bakteriálních buněk. Pokud kit použijeme k barvení dané bakteriální populace, buňky s neporušenými membránami budou zelené, buňky s porušenými membránami budou fluoreskovat červeně. Ve fluorescenčním mikroskopu jsou tyto buňky velmi dobře pozorovatelné na temném pozadí. Barviva bývají dodávána jako roztoky v DMSO.

Životaschopnost určená barvícími metodami neodpovídá přímo schopnosti buněk se množit, ale permeabilitě membrány a aktivitě intracelulárních enzymů. Tyto techniky jsou založeny na schopnosti membrány zabránit pronikání barviva do cytoplazmy živých buněk a naopak neschopnosti mrtvých buněk tomuto procesu zabránit. Rozdíly v zabarvení buněk se projeví tím, že barvivo, které projde membránou do buňky je chemicky změněno metabolickými procesy v cytoplazmě a ztratí schopnost fluoreskovat, nebo je barvivo vázané s buněčnými složkami, čímž dojde ke změně barvy emitovaného záření. Určení životaschopnosti buněk spočívá ve spočítání různě zbarvených buněk. Životaschopnost lze vyjádřit jako poměr počtu živých buněk k jejich celkovému počtu.

Komentáře

Článek nemá žádné komentáře

Vložit komentář




Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné

Pomůžeme vyřešit váš problém

Volejte, pište, vyhledávejte! tel.: 541 149 301, info@chempoint.cz Skype: chempoint.cz

Uživatelské odkazy a odkazy o projektu

O projektu Aktuality Kontakt Cíle projektu Jak publikovat Přihlášení Registrace